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饱和烷烃处理下紫花苜蓿(Medicago sativa)的转录学特征
西北大学生物学科办学100周年专刊 | 更新时间:2024-09-30
    • 饱和烷烃处理下紫花苜蓿(Medicago sativa)的转录学特征

    • Analysis of transcriptome data of Medicago sativa treated with saturated alkanes

    • 李岩

      12 ,  

      李云昊

      12 ,  

      李雅茹

      34 ,  

      赵敏

      12 ,  

      秦天宇

      4 ,  

      王洪粤

      4 ,  

      黄萱

      34 ,  
    • 西北大学学报(自然科学版)   2024年54卷第5期 页码:889-898
    • DOI:10.16152/j.cnki.xdxbzr.2024-05-011    

      中图分类号: S541
    • 纸质出版日期:2024-10-25

      收稿日期:2024-07-30

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  • 李岩, 李云昊, 李雅茹, 等. 饱和烷烃处理下紫花苜蓿(Medicago sativa)的转录学特征[J]. 西北大学学报(自然科学版), 2024,54(5):889-898. DOI: 10.16152/j.cnki.xdxbzr.2024-05-011.

    LI Yan, LI Yunhao, LI Yaru, et al. Analysis of transcriptome data of Medicago sativa treated with saturated alkanes[J]. Journal of Northwest University (Natural Science Edition), 2024,54(5):889-898. DOI: 10.16152/j.cnki.xdxbzr.2024-05-011.

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    摘要

    为探究紫花苜蓿在石油污染下的耐受机理,采用超声碎促溶的方法,将3种有机物(十二烷、十六烷和二十四烷)配置成质量分数均为1%的混合溶液,模拟饱和烷烃污染对紫花苜蓿幼苗进行处理,分别对污染0,6, 24 h的植株取样进行转录组学分析,共获得1 431个差异表达基因(DEGs)。GO富集分析表明,这些DEGs主要涉及蛋白结合、代谢途径和催化活性等;KEGG富集分析表明,DEGs主要富集到植物病原体相互作用、MAPK信号通路和光合生物碳固定途径等。qRT-PCR验证转录组结果可靠。研究结果为研究植物降解和耐受原油中饱和石油烃污染机制原理及后续筛选和培育耐石油污染植物提供理论依据。

    Abstract

    To explore the tolerance mechanism of Medicago sativa under oil pollution, this study adopted the method of ultrasonic crushing and solubilization to prepare a mixed solution of three organic compounds (Dodecane, n-Hexadecane, and n-Tetracosane) at a concentration of 1% to simulate saturated alkanes and treat Medicago sativa seedlings. Samples were taken from plants exposed to pollution for 0h, 6h, and 24h for transcriptomic analysis. The results showed that a total of 1431 DEGs were obtained. GO enrichment analysis indicated that these DEGs were mainly involved in protein binding, metabolic pathways, and catalytic activity. KEGG enrichment analysis showed that DEGs were mainly enriched in plant pathogen interaction, MAPK signaling pathway and photosynthetic biological carbon fixation pathway. qRT-PCR was further used to verify the reliability of the results. This study provides theoretical basis for exploring the mechanism of plant degradation and tolerance of saturated petroleum hydrocarbon in crude oil pollution, as well as subsequent screening and cultivation of petroleum-tolerant plants through transcriptome analysis of Medicago sativa treated with saturated alkanes.

    关键词

    石油烃污染; 紫花苜蓿; 转录组; 差异表达基因

    Keywords

    petroleum hydrocarbon pollutants; Medicago sativa; transcriptome; differentially expressed genes

    石油由气态、液态和固态的烃类组成的混合物,通常贮藏在地壳上层部分[

    1],主要包含各种烷烃、环烷烃、芳香烃等化合物,被称为“工业的血液”[2]。近年来,随着中国工业的蓬勃发展和人们环保意识的日益增强,石油污染问题日益凸显,成为社会各界关注的焦点。为了应对这一挑战,学者纷纷致力于研究如何有效降解和修复进入环境中的石油烃类污染物,以保障生态环境的持续健康发展。相较于传统的物理和化学方法,植物修复技术是一种潜在的环保高效且成本相对低廉的修复方式[3-4]。植物修复首先要保证植物对某种特定污染具有一定的耐受能力,进而可以吸附降解代谢污染物[5]。前人学者研究发现,苜蓿(Richardia scabra)[6]、高羊茅(Festuca arundinacea)[7]、高丹草(Sorghum hybrid sudangrass)[8]和黑麦草(Lolium perenne)[9]等非盐生植物在石油烃污染土壤修复方面具有很大的作用。

    紫花苜蓿(Medicago sativa)属于豆科苜蓿属,为多年生草本植物,主要种植在中国北方干旱、半干旱地区[

    10-11],具有品质好、蛋白质含量高、易生长和繁殖等优点[12-13],被称为“牧草之王”。紫花苜蓿常栽培作禽畜的青绿饲料,也可作蔬菜食用。紫花苜蓿在环境保护和土壤修复方面也具有显著效果,它能有效地减少化学农药的使用,防止农药对土壤和水体的污染[14-15]。紫花苜蓿的深根系能防止水土流失[16],且根系的分泌物含有能够降解石油烃的酶。因此,紫花苜蓿在石油污染土壤的修复方面表现出色,对不同地区、不同浓度的石油污染土壤都具有较好的修复效果。

    紫花苜蓿作为一种重要的牧草,其研究已经越来越深入。王天楚等将紫花苜蓿的种子在不同浓度的镉溶液中处理后继续培养生长,并对其幼苗进行指标测定,发现紫花苜蓿对于镉具有一定的富集作用[

    17]。熊军波等将紫花苜蓿幼苗用NaCl处理9 d后对根部组织进行蛋白质组学分析,揭示了紫花苜蓿响应盐胁迫的分子机制[18]。Gao等将紫花苜蓿幼苗在250 mmol/L NaCl处理后生长0,12,24 h进行转录组分析,发现苜蓿中过表达MsHPCA1可提高其耐盐性[19]。但是,目前关于紫花苜蓿在响应石油污染、在污染土壤进行原位修复的分子机制了解还较少。本研究以紫花苜蓿幼苗为材料,利用十二烷、十六烷和二十四烷3种烷烃的混合物模拟饱和烷烃污染,对其幼苗胁迫处理后进行转录组学分析,探究受石油污染胁迫后引起的基因差异表达模式,为筛选抗性基因并阐明其耐受修复机制提供理论基础。同时,本研究对于土壤修复和环境保护也具有重要理论意义。

    1 结果

    1.1 紫花苜蓿RNA测序质量

    对饱和烷烃胁迫处理前(0 h)和处理后6 h和24 h的紫花苜蓿植株进行转录组的高通量测序。各个样品的GC质量分数均超过42%,且Q20>96%,Q30>94%(见表1)。以紫花苜蓿中苜一号(Medicago sativa L. cv. Zhongmu No. 1)基因组为参考,分别将各样品的过滤数据(Clean Reads)与参考基因组进行序列比对,比对率超过77%,且唯一比对率在73%以上,说明测序结果可信,能满足基因功能注释和分析的需求,可进行下一步分析。

    表1  转录组数据质控分析
    Tab.1  Transcriptome data quality control and analysis
    样本信息有效数据Q20/%Q30/%GC质量分数/%
    CK-1 51137498 97.03 94.88 43.14
    CK-2 44552210 96.83 94.49 42.93
    CK-3 43676428 96.93 94.64 43.22
    WR-6 h-1 47270614 96.93 94.67 43.20
    WR-6 h-2 42207482 96.86 94.52 43.09
    WR-6 h-3 47222008 96.97 94.72 42.97
    WR-24 h-1 48684712 96.87 94.54 42.90
    WR-24 h-2 45004252 96.82 94.59 42.70
    WR-24 h-3 45496924 96.75 94.47 42.72
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    1.2 主成分(Principal Component Analysis)分析

    为了降低数据的复杂性,评估各个样品间的重复性,对9个测序样品进行了主成分分析。结果显示,对照组和处理组之间存在差异,且对照组CK-1、CK-2和CK-3之间重复性较好,模拟石油污染胁迫6 h的WR-6h-1、WR-6h-2和WR-6h-3较为集中,模拟石油污染胁迫24 h的WR-24h-1、WR-24h-2和WR-24h-3的距离较近,样品间重复性合理(见图1)。

    fig

    图1  主成分分析

    Fig.1  Principal component analysis

    注:  PC1为主成分1对区分样本的贡献度,PC2为主成分2对区分样本的贡献度。

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    1.3 差异表达基因分析

    使用基于负二项分布的DESeq2软件对Raw Counts进行分析,并将Padjust<0.05和|log2FC|≥1作为差异基因的筛选标准。结果显示,与对照(CK)组相比,在模拟石油污染胁迫6 h后,共检测到783个差异表达基因,其中480个基因表达上调,而303个基因表达下调。当模拟石油污染胁迫时间达到24 h时,差异表达基因的数量变为582个,其中434个基因表达上调,148个基因表达下调(见图2)。

    fig

    图2  基因差异分析火山图

    Fig.2  Volcano plot of gene differential expression analysis

    注:  FC (Fold Change)为差异倍数。

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    Venn图展示了各个基因集中基因的个数及它们间的重叠关系。将3组CKvsWR-6h、CKvsWR-24h和WR-6hvsWR-24h的DEGs进行比较得到图3。与对照组(CK)相比,模拟石油污染6 h与24 h共有的DEGs 260个,特有的DEGs分别为523和322个,随着污染时间的延长,DEGs会有所不同。

    fig

    图3  差异基因表达 Venn 图

    Fig.3  Venn diagram of differential gene expression

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    1.4 差异表达基因的GO富集分析

    GO数据库(Gene Ontology)是由基因本体联合会(Gene Ontology Consortium)所建立的,是一个国际标准化的基因功能分类体系,可以对基因和蛋白的功能进行限定和描述。分别将CKvsWR-6h、CKvsWR-24h和WR-6hvsWR-24h的DCGs进行GO功能富集分析。

    结果显示,在CKvsWR-6h组〔见图4(a)〕中,差异表达基因显著富集在生物过程(Biological Process,BP)中的水杨酸生物合成过程、水杨酸的代谢过程和氧化还原过程等,细胞组分(Cellular Component,CC)中的细胞膜、质膜、细胞膜固有成分等,以及分子功能(Molecular Function,MF)中的UDP-糖基转移酶活性、血红素结合和己转糖移酶活性等。

    fig

    图4  转录组差异表达基因的 GO富集分析

    Fig.4  GO enrichment analysis of differentially expressed genes from transcriptome data

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    在CKvsWR-24h组〔见图4(b)〕中,差异表达基因显著富集在生物过程(Biological Process,BP)中的次级代谢产物的合成、次级代谢过程和谷胱甘肽代谢过程等,细胞组分(Cellular Component,CC)中的胞外区、淀粉体、细胞膜等,以及分子功能(Molecular Function,MF)中的2-烯醛还原酶(NADP+)活性、硫氧还蛋白二硫化物还原酶活性和蛋白质二硫化物还原酶活性等。

    在WR-6hvsWR-24h组〔见图4(c)〕中,差异表达基因显著富集在生物过程(Biological Process,BP)中的细胞大分子生物合成过程、氧化还原过程和翻译等,细胞组分(Cellular Component,CC)中的核糖体、细胞内解剖结构、小核糖体亚基等,以及分子功能(Molecular Function,MF)中的氧化还原酶活性、抗氧化活性和过氧化物酶活性等。

    以上结果表明,各类膜结构在响应烷烃胁迫时发挥重要的作用,水杨酸、谷胱甘肽代谢过程在模拟石油污染下紫花苜蓿的响应方面产生一定影响,通过调节氧化还原系统及抗性信号转导帮助其缓解烷烃污染胁迫给机体带来的损伤。

    1.5 差异表达基因的KEGG富集分析

    KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的综合性数据库包含了基因、蛋白质、代谢物和信号通路等生物分子的综合信息。将CKvsWR-6h、CKvsWR-24h和 WR-6hvsWR-24h的差异表达基因进行了KEGG富集分析。

    结果显示在CKvsWR-6h组〔见图5(a)〕中,差异表达基因主要富集在植物与病原体的相互作用信号通路、谷胱甘肽代谢信号通路、植物激素信号转导信号通路和有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路等。在CKvsWR-24h〔见图5(b)〕组中,差异基因主要富集在己糖基转移酶活性信号通路、光合作用信号通路、光合作用天线蛋白和次级代谢物的生物合成等。在WR-6hvsWR-24h〔见图5(c)〕组中,差异表达基因主要富集在氧化还原过程信号通路、生物合成过程信号通路、光合过程中碳固定和光合作用天线蛋白等。由以上结果推测紫花苜蓿可能通过生物合成途径、非生物胁迫信号转导途径和各种氧化还原代谢途径来响应烷烃污染的胁迫。

    fig

    图5  转录组差异表达基因的KEGG富集分析

    Fig.5  KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes in transcriptome profiling

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    1.6 差异表达基因的qRT-PCR验证

    转录组测序共获得了1 431个差异表达基因,选取在抗氧化相关信号通路、非生物胁迫相关的信号通路和生长发育相关的信号通路中共10个最显著差异表达的基因进行验证。qRT-PCR验证结果如图6所示。由图6可知,与抗氧化有关的基因(P7、抗坏血酸氧化酶基因、谷胱甘肽-s-转移酶基因、REDOX2、P450、WRKY7)均上调,非生物胁迫有关的转录因子(NACMYB1)也均上调,与生长发育相关的基因GA20ox1上调、花发育相关基因FT下调,这10个基因的表达模式与高通量测序的结果一致,从而证明了转录组测序数据的准确性和可重复性。

    fig

    图6  qRT-PCR验证差异表达基因

    Fig.6  Validation of differentially expressed genes by qRT-PCR

    注:  p值,也称显著性值。以0 h为对照,*p<0.05,**p<0.01和***p<0.001。

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    2 讨论与结论

    紫花苜蓿作为一种重要的牧草,其生长和发育过程中常会受到各种环境胁迫的影响,这些胁迫可能来自干旱[

    20]、土壤盐碱度[21]、重金属污染[22-23]等多种因素。紫花苜蓿在面临胁迫时,会通过一系列的生理反应来应对并维持其生长和代谢活性。先前,赵颖对干旱胁迫下紫花苜蓿的转录组分析,发现无论是施加外源NO供体还是NO清除剂,在分子和生理层面均能有效调控紫花苜蓿的抗旱性能[24];Dong等通过比较转录组分析,并结合过氧化氢酶、过氧化物酶、谷胱甘肽酶和脯氨酸含量的生理变化,揭示了紫花苜蓿在盐胁迫下的响应机制[25]。但是,目前学者对紫花苜蓿应对石油污染胁迫的分子机制研究较少。

    本研究对模拟石油污染处理不同时间的紫花苜蓿植株的转录组进行测序,进而研究紫花苜蓿应对模拟石油污染胁迫的深层机制,对于土壤修复和生态环境保护具有重要意义。本研究从CK vsWR-6h和CK vsWR-24 h中分别获得783个和582个差异表达基因〔见图2(a)、(b)〕,表明模拟石油污染胁迫时可以激活紫花苜蓿的多种修复机制来应对不良环境。

    RT-qPCR具有高灵敏度、高特异性、高通量、实时监测且不受物种限制[

    26-27]等特点被广泛应用于转录组学分析鉴定。紫花苜蓿在经过饱和烷烃污染胁迫处理后,发现与抗氧化相关的基因WRKY7(MsG0180000525.01)上调来响应非生物胁迫,这与魏春梅等通过外施低浓度钛离子发现转录因子WRKY基因家族表达上调研究结果一致[28]NAC基因家族是一类在植物中广泛存在的转录因子家族,在植物应对非生物胁迫反应中具有重要的调节作用[29-30]。本研究中,紫花苜蓿在饱和烷烃胁迫处理后,NAC家族转录因子(MsG0580024680.01)表达量显著上调,与李晓宇等在研究中辽1号杨的NAC2基因在面临镉胁迫时,其表达水平显著上调研究结果一致[31]。植物激素信号转导机制在植物感知和适应外界环境胁迫中发挥着至关重要的作用[32]。这一机制使得植物能够敏锐地察觉外界环境的变化,并通过调节生长、发育和代谢等生理过程,有效应对各种环境压力,从而确保植物在多变的环境条件下能够生存和繁衍。紫花苜蓿经烷烃胁迫处理后,植物激素信号转导通路和MAPK信号转导通路显著富集,与陆程张研究Na2CO3胁迫下玉米苗根部转录组结果一致[33]。本研究为进一步探索紫花苜蓿响应烷烃胁迫提供了有意的借鉴。

    3 材料与方法

    3.1 植物材料

    以紫花苜蓿作为研究材料,用dH2O浸泡过夜后播种到营养土和蛭石1∶1配比的混合土中,在人工气候室(光照强度为100 μmol·m-2;温度25 ℃;光周期为16 h光照/8 h黑暗;空气湿度 65%)内进行培养。

    3.2 模拟石油污染下的胁迫处理

    待播种一周之后,将紫花苜蓿幼苗从土壤里移出,用清水洗干净其根部并移栽到水培箱中进行水培,加入适量的Hoagland培养液[

    34]。待水培生长20 d后,将紫花苜蓿的幼苗移栽至浓度为1%的模拟饱和烷烃污染混合溶液的水培箱中进行胁迫处理。

    1%的模拟饱和烷烃污染混合溶液的配置方法如下:分别称取1 g的十二烷、十六烷和二十四烷于97 mL的ddH2O中,使用超声仪频率为45 kHZ超声30 min直至形成乳浊液。

    分别收集胁迫6 h和24 h后的紫花苜蓿植株,以胁迫前(0 h)的紫花苜蓿植株作为对照,采集的紫花苜蓿植株经液氮研磨成粉末后立即放入-80 ℃冰箱中保存。每个处理组重复3次,每个样品共收集1 g材料。

    3.3 转录组测序

    所有紫花苜蓿样本基于Illumina Novaseq 6000 测序平台完成转录组的测序,测序采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法进行文库构建。

    为保证后续生物信息分析的准确性,使用fastp软件对原始测序数据进行过滤,从而得到高质量的测序数据(clean data),以保证后续分析的顺利进行。使用HISAT2[

    35]软件将质控后的数据与参考基因组(参考基因来源:Medicago_sativa;参考基因组版本:ZhongmuNo. 1)进行比对,获得用于后续分析的mapped reads(可比对上序列比例),同时对本次测序的比对结果进行质量评估。采用Cufflinks[36]软件将mapped reads(可比对上序列比例)进行组装拼接,与已知转录本进行比较,获得没有注释信息的转录本,并对其中潜在的新转录本进行功能注释。

    3.4 差异表达基因DEGs的富集分析

    使用软件RSEM[

    37]分别对转录本的整体表达水平进行定量分析,基因的相对表达量用PTM值衡量。使用BH (fdr correction with Benjamini/Hochberg)方法进行p值的多重检验校正。使用DESeq2[38]软件对原始数据进行分析,基于一定的标准化处理和筛选条件获得比较组间表达差异的转录本;默认参数为:Padjust<0.05及|log2FC|≥1;在GO和KEGG数据库对DEGs的转录本进行注释分析[39]

    3.5 基因的qRT-PCR验证

    将选取的10个显著差异基因进行qRT-PCR分析以验证数据的可靠性。使用Trizol法提取对照组和处理组样品的总RNA,cDNA按照PrimeScript 1st Strand cDNA试剂盒说明书反转录合成。以GAPDH作为内参基因,各基因序列引物设计在附录中(见表2),采用2-△△Ct方法[

    40]计算基因的相对表达量。

    表2  qRT-PCR引物序列
    Tab.2  qRT-PCR primer sequences
    基因编号基因名称正向引物反向引物
    MsG0680034725.01 protein REDOX2-Like TTGGCAGCAAGGGAAACTGA TCCAAGAGCTGACCAAGCAC
    MsG0580024680.01 NAC family transcription factor TGCAATGTCCCTCCTATGGC AGGGGAGATCCAGAAGGTTGA
    MsG0880044306.01 gibberellin 2-beta-dioxygenase 1 TGCACCTTTGCCTTGTCTCA TCTCTCAAAGTGACAAAGCCT
    MsG0380015231.01 glutathione S-transferaseamino-terminal ACACAAGGCATAGCATAGCATA GTCCACCAAAACATAGTGGGG
    MsG0780039504.01 cytochrome P450 76T24 GAGCCGCAATGAAATGGTGC ATAGCTCTGCCATGACCCAC
    MsG0480021753.01 L-ascorbate oxidase homolog GCACAAGTGAATGGCAAGCA CTTCAGAGGAGTGTCGGCTG
    MsG0380016748.01 peroxidase P7 AGAAACTCTGCTCGTGGATTTG CAGCACATGATACAACGCCAG
    MsG0280008006.01 flowering-promoting factor 1-like proten 1 CAATCACGGCATCAGCGAGGAG CTTGCGTAGCCAACACTCTCACC
    MsG0580028960.01 transcription factor MYB1 AGGTGTTGGTTCATACCGCA TGAGCGTTTGTGGAACTGGA
    MsG0180000525.01 transcription factor WRKY7 GACCAACATGTGTGAGAACTATGA ACTTTCACTCTCAGCTTTTCTCTTT
    * GAPDH TCATTCCGTGTCCCAACCG CCACATCATCTTCAGTGTAACCCA
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